PCR实验报告：PCR扩增目的基因

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PCR 扩增目的基因

王瑞斌 1，黄浩哲 2

(1. 西南医科大学，20xx 级口腔 20xx0499120xx1)

(2. 西南医科大学，20xx 级口腔 20xx0499120xx7）

摘要：目的：通过 PCR 技术对目的基因 LDH-B 进行扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳中的扩增

产物条带与 maker 条带进行对比，观察条带位置从而判断目的基因是否扩增成功，熟悉掌

握聚合酶链式反应（PCR）技及原理，了解实验术实验 PCR 扩增引物设计的原理和方法。

结果：电泳条带清晰，各条带分明，见少许拖影现象，泳道见一明一暗两条明显条带，较

浅条带分子量与目的基因相同。结论：实验成功扩增目的基因，但条带不清晰，二者灰度

值差异明显，可能与引物量太多、引物特异性太弱、酶活性降低或 PCR 程序设计不合理等

原因相关。

Abstract: Objective: To amplify the target gene LDH-B by PCR technique, and

then compare the amplified product bands with maker bands in agarose gel

electrophoresis, observe the position of the bands to determine whether the

target gene is amplified successfully, to be familiar with the experimental

techniques and principles of polymerase chain reaction (PCR), and to

understand the principles and methods of PCR amplification primer design.

Results: The electrophoretic bands were clear, each band was distinct, a

little trailing phenomenon was seen, two obvious bands were seen in the lane,

and the molecular weight of the lighter band was the same as the target gene.

Conclusion: The experiment successfully amplified the target gene, but the

bands were not clear, and the difference between the two grayscale values was

obvious, which might be related to too many primers, too weak primer

specificity, reduced enzyme activity or unreasonable PCR program design.

关键词：PCR；目的基因；电泳

1材料与方法

1.1 材料、与器试剂仪

上游引物：LDH-B F 5'-CGGGATCCAAAATGGCAACTCTTAAGG-3'

下游引物：LDH-B R 5'-GGGGTACCTCACAGGTCTTTTAGGTC-3'

将这两条引物序列送生物技术公司合成引物，收到公司合成的引物后分别用灭菌双蒸水配

为10μM 引物溶液。

Taq polymerase（天根生化科技有限公司）。

10×TBE 电泳缓冲液（pH8.3）：取 Tris 108g，Na2EDTA•2H2O 7.44g，硼酸 55g 置于 1L 烧

杯中，向烧杯中加入约 800mL 纯水，充分搅拌溶解。用纯水定容至 1L 后，室温保

存。1×TBE 电泳缓冲液由 10×TBE 电泳缓冲液稀释而来（可稀释至 0.5×TBE 使用），用

作配制琼脂糖凝胶和电泳缓冲液。

6×上冲液：称取溴酚（样缓蓝 bromophenol blue）50mg，二甲苯青（xylene cyanol

FF）50mg，EDTA 0.88g 置于 100mL 烧杯中，向烧杯中加入 40mL 纯水，加热搅拌充分溶

解；加入 36mL 甘油（Glycerol）后，使用 2N NaOH 调pH 至7.0；用纯水定容至 100mL，室

温保存。

10mg/mL EB 溶液：戴手套谨慎称取溴化乙锭（ethidium bromide，EB）200 mg 于棕色试

剂瓶中，加 20mL 双蒸水，充分溶解后室温避光保存。EB 的工作浓度为 0.5g/mL，也可用

10mg/mL EB 溶液配制 5g/mL 的EB 染色液。EB 是一种致癌物质，操作必须小心。

电泳仪、水平电泳槽、移液器、吸头、1.5mL Eppendorf 管（EP 管）、一次性手套、形锥

瓶、100mL 量筒、微波炉、凝胶成像系统、掌式高心机、基因扩增仪

1.2 方法

1.2.1 PCR 反应体系的准备

向容积为 2.5ml 的PE 管中依次加入 PCR Buffer、dNTPs、LDH-B primer F、LDH-B primer

R、Taq polymerase、cDNA template 各2.5μl 及ddH2O10μl。其中，加入 ddH2O 时使用

量程为 10μl 的移液枪，其余试剂使用量程为 2.5ml 的移液枪加入。将 PE 管瞬离心时

10s。

1.2.2 PCR 反应程序的设置

将PE 管放置于 PCR 仪后设定如下循环：（1）95℃，30s；

（2）60℃，30s（3）72℃，30s。总共循环 28 次。

1.2.3 琼脂糖凝胶的制备

使用微波炉（中高火）加脂糖（热琼 2~3min）至清澈透明的溶液，然后用自来水冲洗冷却

至约 60℃；将琼脂糖溶液倒入制胶模具中，凝胶厚度约 5mm，注意避免生气泡；凝胶完产

全凝固后，移去梳子。

1.2.4 加样

PCR 结束后，取出样品，加入 5μl 6×loading buffer 后混匀，瞬时离心，再将 10μl 混

匀样品加入到琼脂糖凝胶样品孔内。将托盘和凝胶放入电泳槽，注意点样端放置于靠近负

极。TBE 缓冲液恰好没过胶面约1mm。

1.2.5 电泳

调节电压为130V，流电为 0.6mA，通。待条区分开后关源。电带闭电

1.2.6 染色

EB 染色 3min，自来水清洗一次

1.2.7 观察

凝胶成像系统照相保存。

2 结果与讨论

2.1 结果

样品在经过染色后呈现出两个清晰的条带，下方的一条较为明显，上方一条较为暗淡。

（如图1）

图一电泳结果

2.2 关于实验结果的讨论

2.2.1 琼脂糖凝胶的制备

琼脂糖凝胶的内部空隙均匀一致性是电泳条带整齐均一不出现偏斜的前提，若在制胶时出

未完全溶解就将凝胶倒入平板，会出凝胶的部分区域空隙大小不一从而致泳物现现导电质

的移动速度不一致，出现条带便宜。琼脂的浓度和电泳带位移速度成负相关。

2.2.2 PCR 体系的制备

PCR 有固定的反应体系成分，包括 PCR Buffer、dNTPs、LDH-B primer F、LDH-B primer

R、Taq polymerase、cDNA template 等各种成分，还有固定体积，通常用ddH2O 配到反应

体系，加量需准确无误，并且避免污染。

2.2.3 电泳条带

影响 DNA 条带扭曲的因素包括电泳缓冲液的种类和浓度、环境温度、凝胶的均一性、琼脂

糖的生产质量[1]。也与上样相关，若不小心破坏了凝胶，也会产生条带的扭曲。该实验

中下方的条带较上方更明显更亮，二者灰度值差异明显，可能是因为引物量太多、引物特

异性太弱、酶活性降低或 PCR 程序设计不合理等原因，从负极往正极分别为 DNA 产物及引

物二聚体。

2.2.4 PCR 引物设计原则

①引物与引物之间不应存在互补序列避免形成稳定的二聚体或发夹结构, 引物与模板的序

②列要紧密互补。在选择用来扩增不同物种 DNA 的引物时, 应避开m RNA 的5′和3′末端

③非翻译区序列。引物长度以及GC 含量合适以保证合适的Tm ④值。引物 3′端不能选择

A, 最好选择 T⑤ ⑥。引物序列在模板内应当没有其他相似性较高的序列。引物 5′端可以

修饰, 3′端不可修饰且要避开密码子第3位[2]。

3 结论

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摘要：

PCR扩增目的基因王瑞斌1，黄浩哲2(1.西南医科大学，20xx级口腔20xx0499120xx1)(2.西南医科大学，20xx级口腔20xx0499120xx7）摘要：目的：通过PCR技术对目的基因LDH-B进行扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳中的扩增产物条带与maker条带进行对比，观察条带位置从而判断目的基因是否扩增成功，熟悉掌握聚合酶链式反应（PCR）技及原理，了解实验术实验PCR扩增引物设计的原理和方法。结果：电泳条带清晰，各条带分明，见少许拖影现象，泳道见一明一暗两条明显条带，较浅条带分子量与目的基因相同。结论：实验成功扩增目的基因，但条带不清晰，二者灰度值差异明显，可能与引物量太多、引...

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